LUPUS ERITEMATOSO SISTEMICO: INDAGINE SUL RUOLO DEI NUCLEOSOMI NELLA PATOGENESI

Dott. Francesca D’Auria 
medico specializzando in Allergologia e Immunologia clinica presso l'Ospedale San Raffaele

 

Alla base della patogenesi del Lupus Eritematoso Sistemico (LES) c’è un’attivazione del sistema immunitario contro molecole dell’organismo stesso (dette antigeni "self") che porta alla produzione di "autoanticorpi". In condizioni di normalità questo non avviene. Rimane ancora da chiarire che cosa possa indurre la reazione del sistema immunitario contro il self e come si mantenga nel tempo.

Ci sono due tipi di morte cellulare: apoptosi e necrosi. La necrosi si verifica in seguito ad un insulto esterno e consiste in un disfacimento disorganizzato della membrana cellulare e delle componenti interne alla cellula.

E’ un processo di morte cellulare programmata nel quale la membrana cellulare resta integra fino agli stadi più tardivi del fenomeno (Wyllie et al., 1980, 1984). L’integrità della membrana cellulare mantiene la separazione tra l’ambiente all’interno della cellula e l’ambiente all’esterno della cellula, impedendo la fuoriuscita degli antigeni contenuti all’interno della cellula, per un tempo sufficiente perché la cellula apoptotica sia eliminata da "cellule spazzino". Un difetto intrinseco delle "cellule spazzino" o una morte cellulare massiva può rendere difficoltosa la rimozione delle cellule apoptotiche. Le cellule apoptotiche non eliminate avranno tutto il tempo per rendere permeabile la loro membrana e rilasciare nel microambiente esterno antigeni endogeni.

Possiamo pensare ai nucleosomi (costituiti da un centro proteico di istoni attorno ai quali è avvolto ad elica il DNA) come se fossero le perline di una collana (la cromatina), in cui il filo è costituito da un particolare tipo di DNA, il DNA "linker".

I nucleosomi isolati si ritrovano fisiologicamente solo in seguito a morte cellulare per apoptosi: in questo processo il "filo" di DNA linker è tagliato e i nucleosomi sono rilasciati singolarmente o in piccoli gruppi (oligonucleosomi) (Enari et al.).

In condizioni fisiologiche le cellule andate incontro ad apoptosi sono eliminate da cellule derivate dal midollo osseo specializzate nella fagocitosi, i macrofagi o "cellule spazzino", che le eliminano definitivamente (fagocitare = mangiare).

Questo meccanismo previene il rilascio di antigeni self dalle cellule apoptotiche nell’ambiente extracellulare e quindi l’attivazione del sistema immunitario contro questi stessi antigeni (Ren & Savill, 1998; Savill & Fadok, 2000, Rovere et al., 2000).

Nelle persone con il LES è stato descritto un difetto nella capacità dei macrofagi di fagocitare le cellule apoptotiche (Hermann et al., 1998). Questo deficit fa sì che le cellule apoptotiche restino nel microambiente per un tempo sufficientemente lungo per permeabilizzare la membrana e permettere la fuoriuscita di antigeni self, tra cui i nucleosomi, contenuti nelle cellule apoptotiche stesse. Questa condizione è definita in termini tecnici "apoptosi tardiva".

Resta quindi la cellula apoptotica non fagocitata e gli antigeni self rilasciati che sono rimossi da altri tipi di cellule che intervengono solo in seconda linea in questo processo di eliminazione: le cellule dendritiche (DC). Queste ultime una volta maturate sono in grado di presentare gli antigeni self fagocitati in modo molto efficace ai linfociti T, attivando la risposta immunitaria (Larsson et al., 2001).

E’ ben noto che il DNA cellulare è un bersaglio della risposta autoimmunitaria del LES.

Rumore e Steinman per primi hanno dimostrato che il DNA purificato dal plasma di pazienti lupici corrisponde a oligonucleosomi (Rumore e Steinman 1990).

Due studi hanno recentemente dimostrato un aumento della concentrazione di nucleosomi circolanti nel sangue di pazienti con LES (Amoura et al., 1997; Williams et al., 2001). Non è stata tuttavia accertata una correlazione tra la quantità di nucleosomi e l’attività della malattia.

Gli anticorpi anti-dsDNA giocano un ruolo centrale nello sviluppo di uno dei più gravi coinvolgimenti d’organo: la nefrite lupica (Pisetsky, 2001).

E’ stato evidenziato recentemente che il processo con cui gli anticorpi anti-DNA si legano alla membrana basale del glomerulo renale può essere mediato dall’interposizione di materiale nucleosomico tramite meccanismi ancora sconosciuti.

Partendo da due ipotesi note in letteratura:

• Le cellule apoptotiche e autoantigeni come i nucleosomi costituiscono un bersaglio per l’autoimmunità
• Nel LES la capacità di eliminare i nucleosomi può essere alterata,

Abbiamo indagato se i nucleosomi, ricavati da cellule in apoptosi in vitro o dal plasma di persone affette da LES, possono stimolare la maturazione delle cellule dendritiche che li fagocitano, con conseguente attivazione dei linfociti T e quindi della risposta immunitaria.

I RISULTATI:

• In vitro abbiamo provocato l’apoptosi di cellule che crescono in coltura (cellule leucemiche Jurkat) e di cellule ricavate dal sangue periferico di persone sane (cellule polimorfonucleate). Abbiamo verificato che, in questa condizione di morte, le cellule, se non sono rimosse per un tempo sufficientemente lungo (24 ore), e quindi se vanno in apoptosi tardiva, rendono la loro membrana permeabile. In tal modo rilasciano nel terreno in cui sono coltivate (surnatante) antigeni self, tra cui i nucleosomi. La presenza di nucleosomi nel microambiente circostante è stata verificata tramite la tecnica di elettroforesi su gel di agarosio.
• Un test ELISA è stato preparato per valutare le concentrazioni di nucleosomi circolanti nel plasma di persone con LES in varie fasi di malattia. Nel nostro studio, il 70% dei pazienti presenta una concentrazione di nucleosomi medio alta se messa a confronto con i risultati ottenuti nei sani e in pazienti affetti da Artrite Reumatoide. Comparando i valori di nucleosomi nei pazienti positivi al test con i valori di SLEDAI (Sistemic Lupus Erythematosuss Disease Activity), è stato osservato che vi è poca o nessuna associazione. Si tratta di risultati ancora preliminari.
• Cellule dendritiche immature sono state trattate con nucleosomi ricavati dal plasma di due pazienti con LES, e con nucleosomi precipitati dalle cellule apoptotiche Jurkat e polimorfonucleate. Analizzando i risultati ottenuti in citofluorimetria, i nucleosomi estratti da pazienti con LES determinano una maturazione delle cellule dendritiche. Anche i nucleosomi ricavati dal surnatante di Jurkat e polimorfonucleati apoptotici inducono la maturazione delle DC. Tuttavia a parità di dose, i nucleosomi ricavati da surnatante di Jurkat apoptotiche portano ad una maggiore maturazione delle DC rispetto a quelli derivati dal surnatante di polimorfonucleati apoptotici.

In questo lavoro dimostriamo che i nucleosomi, generati durante la morte programmata per apoptosi, sono in grado di indurre la maturazione di cellule dendritiche.

Caratteristica della morte programmata è la capacità di conservare integra la membrana fino agli stadi più tardivi del fenomeno. I nucleosomi generati in questo processo rimangono perciò all’interno della cellula in apoptosi e non sono liberati nell’ambiente.

In vivo questo fenomeno è reso possibile dal fatto che fisiologicamente le cellule apoptotiche sono precocemente fagocitate da macrofagi, e il materiale intracellulare è così sequestrato.

In vitro abbiamo utilizzato due modelli di cellule differenti: cellule Jurkat leucemiche, che sono in attiva proliferazione, e cellule polimorfonucleate, che sono in uno stato di quiescenza.

I nostri risultati hanno dimostrato che sia i polimorfonucleati, sia le cellule leucemiche liberano, dopo apoptosi tardiva, nucleosomi nel mezzo extracellulare (surnatante).

Questa considerazione insieme al riscontro di elevati livelli di nucleosomi nel plasma di pazienti con Lupus, ottenuto con il test ELISA, sono compatibili con un modello per cui l’elevata concentrazione di nucleosomi circolanti in pazienti affetti da LES si associa ad un accumulo di cellule in apoptosi tardiva nell’organismo.

Nei pazienti con LES questa condizione potrebbe essere giustificata da:

• un aumento del numero di cellule che vanno in apoptosi nell’organismo, tale da saturare la capacità di "spazzino" dei fagociti professionisti
• un difetto funzionale nella capacità dei fagociti di far fronte alle cellule che muoiono normalmente per apoptosi.

Ci siamo concentrati sulla possibilità che i nucleosomi possano giocare un ruolo patogenetico nella malattia lupica. In particolare abbiamo valutato la capacità di queste molecole, derivate dal plasma di pazienti con LES e da cellule indotte all’apoptosi in vitro, di intervenire nella maturazione delle DC. I nostri dati suggeriscono che i nucleosomi, che si accumulano nei pazienti con LES a causa della pulizia poco efficace delle cellule apoptotiche autologhe sono, in effetti, in grado di determinare maturazione di DC. Suggeriscono inoltre che non tutti i nucleosomi sono uguali. Infatti, le DC maturavano meglio in presenza di nucleosomi provenienti da Jurkat apoptotiche piuttosto che provenienti da polimorfonucleati apoptotici. Il diverso effetto ottenuto utilizzando nucleosomi generati da fonti diverse suggerisce che la capacità di indurre la maturazione delle DC sia determinata da fattori che si associano in maniera diversa al DNA linker di oligonucleosomi. L’identificazione di questi fattori potrebbe essere utile nel disegnare terapie immunomodulanti specifiche in pazienti con LES, volte ad interrompere il circolo vizioso che porta al perpetuarsi della risposta autoimmune.

Amoura, Z, JC Piette, H Chabre, P Cacoub, T Papo, B Wechsler, JF Bach, S Koutouzov. 1997. Circulating plasma levels of nucleosomes in patients with systemic lupus erithematosus. Correlation with serum antinucleosome antibody titers and absence of clear association with disease activity. Arthritis Rheum.40:2217-2225

Enari, M, H Sakahira, H Yokoyama, K Okawa, A Iwamatsu, S. Nagata 1998. Protein, nucleotide, structure A caspase activated Dnase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature.391:43-50

Herrmmann M, RE Voll, OM Zoller, M Hagenhofer, BB Ponner, JR Kalen, 1998. Impaired phagocytosis of apoptotic cell material by monocyte-derived macrophages from patients with systemic lupus erithematous. Arthritis Rheum.41:1241-1250.

Larsson, M, JF Fonteneau, N Bhardwaj. 2001. Dendritic cells resurrect antigens from dead cells. Trends Immunol.22:141-148.

Ren, Y, J Savill. 1998. Apoptosis : the importance of being eating. Cell Death Differ.5:563-568

Rovere P, F Fazzini, MG Sabbadini, AA Manfredi. 2000. Apoptosis and systemic autoimmunity: the dendritic cell connection. Eur J Histochem.44:229-236

Rumore, PM, CR Steinmam. 1990. Endogenous circulating DANN in systemic lupus erithematosus. Occurrence as multimeric complexes bound to histones. J clin Invest.86:69-74.

Savill, J e V Fadok, 2000. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature.407:784-788.

Williams, RC Jr, CC Malone, C Meyers, P Deckere, S Muller 2001. Detection of nucleosome particles in serum and plasma from patients with systemic lupus erythematosus using monoclonal antibody 4H7. J Rheumatol. 28:81-94.

Wyllie, AH, JFR Kerr, AR Curie. 1980. Cell death: the significance of apoptosis. Int. Rev. Cytol. 68:251-306

Wyllie, AH, RG Morris, AL Smith, D Dunlop. 1984 Chromatin cleavage in apoptosis: association with condensed chromatin morphology and dependence on macromolecular synthesis. J Pathol. 142:67-77.

Pisetsky, DS 2001. Immune responses to DNA in normal and aberrant immunity. Immunol Res. 22:119-126.